Прокопенко валентина михайловна про- и антиоксид

^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты в митохондриях плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах

В последние десятилетия одним из подходов для изучения изменений в процессах свободнорадикального окисления (СРО) биологических объектов, в частности митохондрий, является измерение уровня интенсивности хемилюминесценции . Кинетика люминолзависимой ХЛ отражает кинетику образования и расходования АФК. Изменение интенсивности люминолзависимой ХЛ в митохондриях плаценты мы оценивали по интегральному показателю – светосумме вспышки.

Результаты собственных исследований показали, что в митохондриях, выделенных из плацент женщин при поздних сроках невынашивания (преждевременные роды), уровень интенсивности процессов свободнорадикального окисления в периферической части плаценты был выше на 24% (р
Вместе с тем, нами установлено, что уровень активности ГП в митохондриях плацент женщин при преждевременных родах был ниже, чем таковой у пациенток с неосложненным течением беременности, завершившейся родами в срок (Рис. 1) Не выявлено изменений в уровнях активности СОД в митохондриях плацент у женщин обследованных групп.


Таблица 1

Интенсивность хемилюминесценции и общей антиоксидантной активности в митохондриях плацент женщин при физиологической беременности, завершившейся родами в срок, и при преждевременных родах



Подгруппы женщин

Интенсивность хемилюминесценции

(отн. ед/мг белка)

Общая антиоксидантная

активность

(отн. ед)

Центральный участок

плаценты

Периферический участок плаценты

Центральный участок

плаценты

Периферический участок плаценты



Преждевременные

роды

(n=8)


3500.1±182.6^^



4514.8±290.9*



1,695±0,046*




2,164 ± 0,114*^


Физиологическая

беременность, завершившаяся родами в срок

(n=8)


3429,6±250,8


3652.2±309.4



1,14 ± 0,04


1,19±0,062

Примечание: * р
физиологической беременностью, завершившейся родами в срок;

^^р
преждевременными родами;

* р
беременностью;

^ р


^ Рис.1. Активность глутатионпероксидазы в митохондриях плацент женщин с физиологической беременностью, завершившейся родами в срок, и при преждевременных родах

Примечание: *р

Полученные данные свидетельствуют о том, что в митохондриях плаценты при преждевременных родах наблюдается развитие окислительного стресса, протекающее на фоне подъема активности прооксидантной системы митохондрий, выделенных из периферической части плаценты, и ослабления функционирования в них глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.

^ Оценка интенсивности процессов свободнорадикального окисления в постмитохондриальной фракции плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах

Механизмы появления АФК в клетке связаны не только с нарушениями функционирования электронно-транспортных цепей в митохондриях. Генерация АФК происходит при окислительно-восстановительных реакциях, протекающих с участием кислорода в различных субклеточных структурах клетки (Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006; Октябрьский О.Н., 2007). В микросомах наблюдается генерация АФК как результат функционирования гидроксилазной ферментативной системы с участием цитохрома Р-450 ( Арчаков А.И., 1975, 1998).

Наши исследования показали, что величина Л-ХЛ в постмитохондриальной фракции периферической части плацент у женщин с самопроизвольным преждевременным прерыванием беременности на 42% превышает интенсивность Л-ХЛ в плацентах женщин с неосложненным течением беременности, завершившейся родами в срок. В центральной части плацент женщин обследованных подгрупп различий в интенсивности Л-ХЛ не наблюдалось (табл.2).

Таблица 2.

Интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции в постмитохондриальной фракции плацент женщин с физиологическим течением беременности и преждевременными родами


Подгруппы женщин




Область плаценты


Центральная


Периферическая

СС

(отн. ед/мг белка)

МВ

(отн.ед)

СС

(отн. ед/мг белка)

МВ

(отн.ед)

Преждевременные

роды

(n=20)


257.35±25.84



3.5±0.5


102.20±14.01**



3.0±0.4

Физиологическая

беременность, завершившаяся родами в срок

(n=16)


228.98±37.12***



4.2±0.5*



59.71±4.09


2.6±0.4

Примечание: *р
** р
*** р
СС – светосумма, МВ – максимальная вспышка.


Интенсивность ХЛ, по данным ряда исследователей (Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989; Федорова Т.Н и соавт., 1991; Болдырев А.А., 2001), тесно связана с процессами развития перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификацией белков (ОМБ).

Как показали наши исследования при преждевременных родах в периферической области плацент отмечалось увеличение на 62% (р

Таблица 3.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов и карбонильных производных белков в постмитохондриальной фракции плацент женщин с физиологическим течением беременности и при преждевременных родах




Подгруппы женщин



Участок плаценты



Содержание МДА

(нмоль/мг белка)



Содержание карбонильных производных (мкмоль/мг белка)




Преждевременные роды

(n=20)

центр

4.18±0.52


1.96±0.34


периферия

4.28±0.65*


2.22±0.28


Физиологическая беременность, завершившаяся родами

(n=16)

центр

3.95±0.64


1.85±0.20


периферия

2.64±0.3


1.74±0.13


Примечание: *р

Полученные нами результаты позволяют полагать, что усиление процессов СРО в плацентах женщин при преждевременных родах в 28 – 36 недель связан преимущественно с активацией процессов ПОЛ.


^ Механизм люминолзависимой хемилюминесценции в тканях плацент женщин при преждевременных родах и физиологической беременности, завершившейся родами в срок

Как известно, люминолзависимая хемилюминесценция (Л-ХЛ) связана с образованием супероксидного и гидроксильного и/или гипохлоритного радикалов (Владимиров Ю.А., 1989; 1998). Для того чтобы выяснить степень вовлеченности различных радикалов в процессы СРО в плацентах женщин, исследуемые с помощью ХЛ анализа, было изучено влияние на интенсивность Л-ХЛ специфических ловушек АФК в экспериментах in vitro: азида натрия, метионина, супероксиддисмутазы. Об участии в развитии Л-ХЛ гипохлорита – продукта окисления хлорида под влиянием миелопероксидазы (МПО) при взаимодействии с перекисью водорода, свидетельствует факт тушения ХЛ азидом натрия, который ингибирует активность МПО, и метионина, являющегося перехватчиком гипохлоритного анионрадикала (СОД – независимый механизм). Развитие Л-ХЛ в присутствии О2 - и ОН· радикалов ингибируется СОД (СОД-зависимый механизм) (табл. 4).

Таблица 4

Влияние тушителей на люминолзависимую хемилюминесценцию в постмитохондриальной фракции плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах


Подгруппы женщин

Участок плаценты

Ингибирующий эффект на Л-ХЛ, %

СОД (250 мкг/мл)

Азид натрия (0.025 мМ)

Метионин (0,4 мкМ)

Преждевременные роды

(n=8)

центр

52.5±4.5


15.6±1.9***


31.6±4.9*


периферия

53.7±6.3


28.0±1.8***


33.6±3.2*


Физиологическая беременность, завершившаяся родами в срок

( n=8)

центр

49.4±4.6


59.5±8.2


50.2 ±3.4


периферия

69.6±8.1


58.4±7.2


54.0±8.0




Примечание: *р

Введение СОД практически одинаково ингибировало интенсивность Л-ХЛ как в центральной, так и периферической частях плаценты женщин обследованных групп. Азид натрия ингибировал интенсивность Л-ХЛ в центральной и периферической частях плацент женщин с физиологическим течением беременности почти на 60%. У женщин, беременность которых окончилась преждевременными родами, азид натрия ингибировал интенсивность ХЛ на 44 % (р
Для более полного представления о вкладе различных радикалов в процессы СРО в плацентах женщин, определяемые с помощью ХЛ анализа, исследовали влияние на интенсивность Л-ХЛ в плацентах женщин обследованных групп различных соединений, которые отличаются между собой по структуре и эффективности инактивации свободных радикалов (табл.5)

Таблица 5

Величина I50 для низкомолекулярных ингибиторов люминолзависимой хемилюминесценции в постмитохондриальной фракции плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах


Соединение

Величина I50 (нмоль/мл)

Физиологическая беременность, завершившаяся родами в срок

(n=8)

Преждевременные роды

(n=8)

Цистеин

290.0±91.0

340.0±75.0

Аскорбиновая кислота

300.0±65.0

250.0±60.0

НАДН

3.0±0.85

1.7± 0.41

Таурин

23100.0±930.0

18600±721.0**

Мочевая кислота

0.071±0.01

0.028±0.009**

Глутатион восстановленный

1.0±0.3

1.0±0.5

Примечание: ** р
I50 - концентрация, при которой происходит 50%-ное тушение Л-ХЛ


Исследуемые соединения тушили Л-ХЛ в постмитохондриальной фракции плацент женщин обеих групп. Степень ингибирования интенсивности хемилюминесценции зависела от концентрации соединений. Эффективность исследуемых веществ варьировала в пределах нескольких порядков. Цистеин, аскорбиновая кислота, НАДН, глутатион восстановленный оказывали равнозначный ингибирующий эффект на Л-ХЛ постмитохондриальной фракции плацент женщин обследованных групп. Величина I50 мочевой кислоты, способной инактивировать пероксинитрит, образующийся в реакции взаимодействия оксида азота с супероксидным анионрадикалом (Зенков Н.К.и соавт., 2001), была выше в 2,5 раза в постмитохондриальной фракции плацент женщин с неосложненной беременностью. Концентрация I50 таурина, инактивирующего гипохлоритный анион радикал с образованием аминосоединений (Говорова Н.Ю. и соавт, 1988), в плацентах женщин при физиологической беременности 1,2 раза превышала таковую при преждевременных родах.

Полученные данные позволяют говорить об участии одновременно двух механизмов возникновения Л-ХЛ в постмитохондриальной фракции плацент: СОД-зависимого, характеризующегося присутствием в среде радикалов О2· и ОН·, и СОД-независимого, когда свечение возникает в присутствии радикалов СlO·. Причем относительный вклад последнего механизма в возникновение Л-ХЛ был существенно ниже в плацентах женщин при преждевременных родах.

В организме человека гипохлоритный анионрадикал образуется в результате реакции взаимодействия перекиси водорода с ионами хлора. Реакцию катализирует фермент миелопероксидаза (МПО).

Как показали собственные исследования, максимальное содержание МПО наблюдалось в первом триместре беременности. На протяжении беременности содержание фермента снижалось в плацентах женщин обследованных групп. При невынашивании беременности содержание фермента в первом триместре беременности в 4,5 раза превышало уровень МПО в плацентах женщин с физиологическим течением беременности , во втором триместре - в 3 раза как в центральном участке плацент, так и по периферии. В третьем триместре беременности содержание МПО было ниже в 3 и 2,2 раза соответственно в центральном и периферическом участках плацент женщин при преждевременных родах по сравнению с плацентами женщин с физиологической беременностью, завершившейся родами в срок (рис.2 а, б). Более низкое содержание МПО в плацентах женщин в третьем триместре при самопроизвольном преждевременном прерывании беременности приводит к ослаблению микробицидной функции плаценты.



а



б

Рис.2 а, б. Содержание миелопероксидазы в постмитохондриальной фракции плацент женщин при невынашивании и физиологической беременности на протяжении беременности.

Примечание: **р
показателям группы женщин при физиологической беременности

Наряду с МПО в литературе уделяется особое внимание антимикробным свойствам оксида азота (Melkova Z., Tsteban M., 1995). Цитотоксическое действие оксида азота во многом зависит от интенсивности образования NO· и продуктов его метаболизма: нитрита, нитрата, пероксинитрита (Graziewicz M.A., 1996; Moriya R. et al, 2000). В плаценте обнаружено два изофермента NO-синтазы: эндотелиальная (III тип) (Eis E.L. et al., 1995) и индуцибельная (II тип) (Myatt et al., 1997).

Определение динамики активности NO-синтазы позволило установить, что на ранних сроках беременности отличий в уровне активности фермента в плацентах женщин обследованных групп не наблюдалось. На протяжении беременности активность NO-синтазы в плацентах женщин при невынашивании не менялась по центру, уменьшалась по периферии и в третьем триместре была ниже в периферическом участке, чем у женщин с физиологическим течением беременности (рис.3 а, б), что говорит о снижении образования оксида азота.



а



б

Рис.3а, б. Уровень активности NO-синтазы в постмитохондриальной фракции плацент женщин при невынашивании и физиологическом течении на протяжении беременности

Примечание: *р
плаценты женщин с невынашиванием;

Анализ представленных результатов исследований свидетельствует о том, что дисфункция плаценты характеризуется изменением вклада различных АФК в процессы СРО, что приводит к ослаблению ее защитных свойств.

^ Изучение антиоксидантной системы в постмитохондриальной фракции плацент женщин с физиологическим течением беременности и при невынашивании

Содержание эндогенных АФК, образующихся в клетках плаценты, поддерживается на определенном уровне для обеспечения основных метаболических функций плаценты. Это осуществляется за счет функционирования многокомпонентной АОС, разнообразной по механизмам действия и химической структуре. Вклад отдельных компонентов в общий антиокислительный потенциал плаценты различен, в связи с чем важным является исследование резервов антиокислительной защиты в плаценте при физиологической беременности, завершившейся родами в срок и при самопроизвольном прерывании беременности в 28 – 36 недель (преждевременные роды).

Нами не выявлено различий в величине общей антиокислительной активности, в уровнях активностей СОД и каталазы в постмитохондриальных фракциях плацент женщин обследованных групп. Между тем, содержание небелковых SH-групп в центральных и периферических участках плацент женщин с преждевременными родами было меньше по сравнению с уровнем SH-групп в плацентах женщин с физиологической беременностью (рис.4). Основным низкомолекулярным SH-соединением в организме является глутатион, клеточный пул которого формируется в результате динамического равновесия процессов его биосинтеза и деградации.

Уровень активности глутатионпероксидазы (ГП) в плаценте женщин при самопроизвольном прерывании беременности был выше более чем в 2 раза уже в 1 триместре беременности и оставался высоким во II и III триместрах. На протяжении всего срока беременности активность фермента в плаценте женщин при невынашивании превышала более чем в 1,5 раза величину активности фермента в плацентах женщин при физиологическом течении беременности. Активность ГП не зависела от локализации фермента в плацентах (центр – периферия) женщин обследованных групп. Более высокую активность фермента во II триместре при физиологическом течении беременности мы связываем с применением интраамниального введения энзапроста (простагландин Е2 ) при прерывании беременности по социальным показаниям (рис. 5).




^ Рис.4. Содержание небелковых SH-групп в постмитохондриальной фракции плацент женщин при физиологической беременности и преждевременных родах.

Примечание: **p